شرکت یکتا تجهیز آزما

مولکول DNA دی ان ای با نام شیمیایی دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید ، شامل تمام اطلاعات ژنتیکی و خصوصیات وراثتی موجودات زنده است . این مولکول شامل دو رشته و مارپیچ است که از لحاظ ظاهری به شکل مارپیچ دو‌تایی می باشد و در تمام سلول‌های موجودات زنده وجود دارد و از سلول‌های والدی به فرزندان منتقل می شود . پراکندگی DNA در همه ی قسمت ها و ارگان های موجود زنده وجود دارد . امروزه با استفاده از کیت استخراج DNA از بزاق ، اقدام به استخراج DNA از بزاق می نمایند و به بررسی اطلاعات ژنتیکی فرد می پردازند .
دی ان ای (DNA) حامل کلیه ی کدها ، اطلاعات ژنتیکی کلیه جانداران و حتی ویروس‌ها است و همه ی این اطلاعات جهت رشد ، تکامل و زیست ، تولید مثل و سایر واکنش های موجودات زنده ، از موارد ضروری به حساب می آیند . جایگاه DNA در هسته سلول است که در واقع مرکز ارسال نسخه ‌های ساخت پروتئین‌ها و RNAهای موجود در بدن جانداران می باشد . درشت مولکول DNA یک پلیمر بلند از مولکول‌های قند ۵ کربنی ( پنتوز ) ، فسفات به همراه بازهای آلی نیتروژن‌دار است . دئوکسی‌ریبوز نام قند پنتوز و اسید نوکلئیک نشان دهنده فسفات و بازهای آلی موجود در مولکول است .
به ظاهر ساختمان DNA با سه بخش قند ، فسفات و بازهای نیتروژنی ، ساده است ، ولی روش و نظم قرارگیری این بازها منجر به وجود آمدن پیچیدگی‌ها و تفاوت های بی نهایتی در مولکول DNA شده است و نتیجه آن وجود تفاوت ها و تنوع در کلیه ی جانداران شده است . در این مقاله به بررسی کیت استخراج DNA از بزاق می پردازیم .
شرح مختصری از غدد بزاقی
سه غده اصلی بزاقی در دهان به عنوان زیر زبانی ، بناگوشی و زیر آرواره ای وجود دارد که غدد بناگوشی به عنوان بزرگترین غدد بزاق در دهان به حساب می آید . بزاق در نقش یه روان کننده باعث حرکت غذا در مسیر لوله های گوارشی می شود . در بزاق آنزیمی به نام آمیلاز وجود دارد که نقش مهمی در تجزیه نشاسته دارد . PH بزاق از نواحی بدن همیشه پایین تر است و این به دلیل خصوصیت اسیدی آن به واسطه ی وجود بیکربنات و فسفات در آن است . در واقع میزان روان و رقیق بودن بزاق با غلظت بیکربنات ، فسفات و کراید سدیم بستگی مستقیم دارد . بعلاوه بین دی اکسید کربن موجود در خون و نیز غلظت بیکربنات در بزاق ارتباط مفهوم داری جود دارد .از جمله نقش بزاق در دهان کمک به حفظ رطوبت کافی در دهان و محا فظت از رشد باکتری ها می باشد و نیز به سلامت و جلوگیری از پوسیدگی دندان ها کمک قابل توجهی می کند و همه ی این وظایف به واسطه ی وجود آنزیم لیزوزیم می باشد . همچنین بزاق به سبب دارا بودن ماده ای به نام موسین از آسیب و صدمه به مجاری گوارشی در زمان عبور مواد غذایی جلوگیری می کند و این محافظت را با افزایش آب و تشکیل مخاط در اطراف مواد غذایی انجام می دهد .

ژنتیک و تاثیر آن بر زندگی انسان
موجودات زنده حاصل تجمع میلیونها سلول هستند که هر کدام از آن ها حاوی دسته ای از فعالیت ها و عملکرد های متفاوت در بدن هستند ، این فعالیت ها وعملکرد ها تحت عنوان ژنوم شناخته می شود و سال ها مورد توجه دانشمندان بوده اند و همیشه مرکز توجه برای بررسی محققان و پژوهشگران بوده اند . در واقع ژنوم عامل تفاوت ظاهری در بدن موجودات زنده هستند و نیز دلیل تفاوت در خصوصیات شخصیتی ، رفتاری و توانایی ها و ناتوانی های انسان ها می باشد .

با پیشرفت علوم ژنتیک و زیستی ، محققان و پژوهشگران توانسته اند با علوم و تکنیک توالی یابی ژن ها ، انسان را از وجود بسیاری از ویژگی ها آگاه کنند و نیز از بسیاری از عوامل بیماری ها را کشف و بررسی کرده اند و توانسته اند برای مهار آن ها چاره اندیشی کنند. امروزه دانشمندان با پیشرفت علم ژنتیک و هوش مصنوعی توانسته‌اند با توالی‌یابی این ژن‌ها، فرد را از احتمال بروز این ویژگی‌ها آگاه کنند . تا چند سال پیش ناحیه ی تمرکز و مورد مهم برای دانشمندان بررسی محتمل بعضی از بیماری ها من جمله انواع سرطان ها بود و این تحقیق و بررسی به آن جا رسید که بسیاری از بیماری های وراثتی اعم از یک سری سرطان های وراثتی برای انسان مشخص شد .همه ی این شناخت ها و کشفی در مسیری اتفاق افتاد که منجر به ظهور پزشکی شخصی شده ( Personalized medicine ) گردید .

پزشکی شخصی عرضه ی خدمات پزشکی اعم از تشخیص ، پیشگیری و درمان به واسطه ی خصوصیات مولکولی و ژنتیک هر انسان می باشد . در واقع پزشک با شناخت و در دست داشتن اطلاعات پنهان در پروفایل مولکولی فرد ، قادر است برای درمان از موثرترین دارو و دوز درمانی استفاده کند و با تغییر در سبک و استایل زندگی و رژیم ها ی غذایی در جهت پیشگیری ، درمان و مراقبت ها موثر تر عمل کند .
برای دستیابی به تمامی این اطلاعات ، باید ابتدایی ترین فرآیند علوم ژنتیک انجام شود که استخراج DNA می باشد. با استفاده از کیت استخراج DNA از بزاق ، می توان به اطلاعات مورد نظر دسترسی پیدا کرد .
محققان با استفاده از کیت استخراج DNA از بزاق به اطلاعات ژنتیکی دسترسی پیدا کرده و به تحلیل ویژگی ها و صفات فرد می پردازند . آنها با استفاده از اطلاعات ژنتیکی و نیز عوامل محیطی خدمات پزشکی کامل تری نسبت به پیشگیری و یا درمان به افراد ارائه می دهند .
در واقع ساده ترین روش برای دستیابی به DNA ، استفاده از کیت استخراج DNA از بزاق می باشد .که در این حالت نمونه گیری با استفاده از سواب دهانی انجام می گیرد . در این متد ، همانطور که اشاره شد برای فرآیند استخراج اسیدنوکلئیک ، از کیت استخراج DNA از بزاق استفاده می شود. برای نمونه گیری ، محقق از یک سواب استریل استفاده میکند . در واقع از سلول های دهانی و داخلی گونه اقدام به نمونه گیری می کند. مسئله ی مهم این است که از نواحی خراشیده و زخم برای برداشت نمونه استفاده نمی کند. این سواب های حاوی سلول دهانی دارای DNA هستند .
در شرایطی دیگر برای استخراج DNA از بزاق ، اقدام به جمع آوری بزاق فرد می کنند ، به گونه ای که فرد بزاق خود را در ظرف مخصوص جمع آوری نمونه ی بزاق می ریزد. برای استخراج DNA از بزاق در کودکان و نوزادان ، محقق از اسفنج استفاده می کند .
در صورت تمایل و نیاز به کیت استخراج DNA از بزاق میتوانید با شرکت یکتا تجهیز آزما تماس بگیرید

آغازین و پیش نیاز علوم زیست شناسی مولکولی ، استخراج DNA ژنومی با کیفیت و غلظت بالا می باشد که نتیجه ی استخراج اسیدنوکلئیک بدون نقص ، منجر به تکثیر DNA به  وسیله ی روش های مولکولی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR) می شود .

بسیاری از عوامل می توانند در فرایند استخراج DNA ژنومی و کسب محصول DNA با کیفیت و خلوص عالی دخیل باشند . از جمله مواردی که در پروسه ی استخراج DNA ، تاثیر گذار هستند می توان به  عاری بودن آلودگی به RNA ، لیپید ها ، پروتئین ها اشاره کرد . همچنین کیفیت عالی DNA  می تواند به فاکتورهایی وابسته با بعضی از ساختارهای مداخله گر در پلی مرازها و آنزیم های برشی مرتبط باشد . گاهی با توجه به دلایل و شرایط ویژه ای ، محقق  می بایست نمونه ی بافت را در شرایط خاصی برای مدت طولانی نگهداری و محافظت کند تا در زمان مورد نظر شروع به انجام فرایند استخراج DNA از نمونه کند . یکی از روش های نگهداری نمونه ی بافت در مدت زمان طولانی، تثبیت کردن بافت با فرمالین و پارافینه کردن نمونه است . در واقع پارافینه کردن نمونه ، جهت حفظ و مراقبت در بانک های نگهداری بافت ، یکی از رایج ترین و مهم ترین روش های نگهداری نمونه های کلینیکی به حساب  می آید .

اغلب نمونه ها در ابتدا با فرمالین عمل تثبیت در آن ها انجام می شود و سپس در قالب بلوک های پارافین حفظ و نگهداری می شوند . امروزه اهمیت استفاده از این روش بسیار  احساس می شود چرا که به پاتولوژیست امکان  استفاده از نمونه های بایگانی شده جهت مطالعات گذشته نگر زیست مولکولی را می دهد . بدیهی است با پیشرفت روز افزون علوم ژنتیکی ، در سر تا سر دنیا از روش پارفینه کردن نمونه در آزمایشگاه ها ، بیمارستان ها و  مراکز تحقیقاتی  استفاده می شود . نمونه های تثبیت شده  با فرمالین و یا فیکس شده در پارافین  به دلیل اثرات مخرب مواد ثبیت کننده می تواند بر کیفیت مطلوب DNA موثر باشد و با کیت های عمومی نمی توان محصول DNA با کیفیت را داشته باشیم .

همان طور که در بالا گفته شد ، بلوک های پارافینه از ماخذ مهم جهت بررسی ، پژوهش و تحقیق در زمینه ی  پیشینه های ژنتیکی هستند اما گاهی رپرتاژهایی حاکی از خلوص پایین DNA استخراج شده دریافت می شود که نشان از ضعف کیت های عمومی در این فرایند است  .  بنابراین شرکت های فعال در زمینه بیولوژی مولکولی ، اقدام به طراحی و توزیع کیت هایی کرده اند که کاربر قادر باشد محصول DNA با غلظت بالا را از نمونه های ثابت شده با فرمالین و پارافینه شده که بیش از پنج سال از عمر آن ها میگذرد را جدا سازی نماید .  بدین سبب استفاده از کیت صحیح و کارامد جهت انجام این فرایند بسیار حائز اهمیت است .

کیت استخراج DNA ژنومی از بافت پارافینه کمپانی Favorgen  تایوان تمامی عواملی که می تواند در استخراج DNA ژنومی با کیفیت عالی دخیل باشد را در یک مجموعه برای محقق فراهم کرده است . لازم به ذکر است شرکت یکتاتجهیزآزما تنها نماینده انحصاری کمپانی Favorgen تایوان در ایران است که بصورت فعال چندین سال فروش و خدمات پس از فروش محصولات این کمپانی را عهده دار است .

در ابتدا توجه شما را به توضیح مختصری در مورد آماده سازی نمونه با پارافین و فرمالین جلب می نماییم :

همان طور که گفته شد گاهی با توجه به شرایط خاص محقق و یا پاتولوژیست لازم می بیند که فرایند استخراج را بعد از یک مدت طولانی انجام دهد . برای نگهداری طولانی مدت نمونه ، باید شرایط خاصی در نظر گرفته شود . یکی از روش های رایج  و متداول جهت نگهداری نمونه ها ، بلوک های پارافینه می باشد که  محاسن  خود را دارد . فاکتورهایی ممکن است در طی مطالعه و بررسی ژنتیکی وجود داشته باشد که اسباب و اام  نگهداری نمونه ها را فراهم کند . به عنوان مثال  در یک سری از بررسی ها و مطالعات ، به دلیل عواملی من جمله محل خاص نمونه گیری و یا دردناک بودن نمونه گیری برای بیمار  و نیز دیگر عوامل مثل پر هزینه بودن و محدودیت های اخلاقی ، دسترسی به نمونه ی تازه بسیار محدود می شود و در این شرایط محقق و یا پاتولوژیست می تواند به  بایگانی نمونه های تثبیت شده در پارافین رجوع کند .

برای این شرایط ویژه ، نمونه ی بافت باید با شرایط مخصوصی نگهداری شود بطوریکه ساختارهای داخلی و فاکتورهای ژنتیکی آن نسبت به زمان حیات بدون تغییر باقی بماند و در واقع  اسیدنوکلئیک سلول ها بدون تغییر حفظ شود . تهیه و مراحل تثبیت نمونه مراحل متعددی دارد که باید با دقت انجام شود . در ابتدا عمل تثبیت یا فیکساسیون انجام می شود که کشتن هم زمان یاخته های یک بافت است . در حقیقت مواد پروتوپلاسمی نمونه ، بدون تغییر در ساختار آن ها منعقد می شود . مواد ثبیت کننده شامل دو دسته ی مواد آلی و غیز آلی هستند  که در بین آنها می توان به اتانول ، استون و فرمالین اشاره کرد . مرحله بعدی در  تثبیت نمونه ی بافت شستشو و سپس آب گیری یا دهیدراسیون نمونه است . شستشوی نمونه را می توان با آب جاری انجام داد و آب گیری توسط مواد آب گیرنده انجام میشود که این مرحله توسط الکل طی چندین مرحله و پی در پی صورت می گیرد .  سپس مرحله استفاده از پارافین جهت استحکام نمونه است که محیطی پایدار برای نمونه فراهم می کند و برای این مرحله ابتدا پارافین را در حمام آب ذوب کرده و بعد نمونه ها را در سه مرحله داخل آن قرار می دهیم . در مرحله بعدی با استفاده از گلیسرول داخل قالب را چرب کرده و کمی پارافین مذاب داخل آن می ریزیم سپس با استفاده از یک پنس ، نمونه را داخل آن گذاشته و مجدد روی آن را با پارافین می پوشانیم . مرحله ی نهایی در نگهداری نمونه در بلوک های پارافین ، برش گیری است که بوسیله ی دستگاهی به نام میکروتوم انجام می گیرد . به این ترتیت نمونه را می توان برای مدت طولانی نگهداری کرد.

همان طور که در بالا  اشاره شد محقق لازم است برای استخراج DNA  با خلوص بالا و کیفیت عالی از یک کیت کارآمد و بهینه برای فرایند استخراج DNA از بافت تثبیت شده در پارافین استفاد کند . کمپانی Favorgen تایوان ، کیت استخراج منحصر به نمونه های فیکس شده در پارافین ارائه داده است که تمامی نیاز محقق را  تامین می کند . ساختار این کیت ستونی و با غشای سیلیکا ماتریکس است . ارزیابی کمی و کیفی برای روی  محصول DNA  استخراج شده با استفاده از کیت استخراج DNA  از بافت پارافینه حاکی از کیفیت ، کارایی و کارآمدی این محصول نسبت به محصولات مشابه در بازار است . بررسی میزان تکثیر نمونه ها ، نشان دهنده ی غلظت و خلوص DNA استخراج شده با استفاده از این کیت بوده است .

شناسایی موثرترین و کارآمد ترین روش ها در  استخراج DNA  برای نمونه های پارافینه برای پاتولوژیست جهت بررسی و شناسایی عوامل بیماری زا ، تشخیص پزشکی و مطالعات ژنتیکی بسیار حائز اهمیت است . امروزه با استفاده از متد ستونی استخراج DNA و نیز تنوع محصولی در این زمینه  و همچنین محصولات منحصر به هر موضوع ژنتیکی ، مشکلات  آنالیز DNA  مرتفع شده و در نتیجه تکثیر DNA به  وسیله ی روش های مولکولی مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR) بسیار مورد قبول ،  شده است و تشخیص پزشکی در مسیر صحیح خود قرار گرفته است .

قبل از شروع به کار  با این کیت ، دو ماده زایلین  و  RNase A را که از مومات جانبی  کار محسوب می شوند و در کیت فراهم نشده است ، را تهیه کنید . زایلین به عنوان یک حلال  جهت پارافین زدایی مورد استفاده قرار می گیرد . توجه داشته باشید که هنگام استفاده از زایلین نکات ایمنی را رعایت کنید تا از آسیب های فیزیکی آن در امان باشید . استفاده از زایلین بدون رعایت کردن نکات ایمنی می تواند منجر به سوزش بینی ، گلو ، سردرد ، عدم تعادل در عضلات ، سرگیجه ، ایجاد مشکلات در سیستم تنفسی و ریه ها  و یا تأخیر در واکنش های مربوط  به محرک‌های بصری  ، مشکلات قلبی و حتی در موارد جدی تر منجر به ایجاد سرطان شود .

استفاده از آنزیم RNase A در این کیت بصورت اختیاری و صرفا برای حذف RNA لازم می باشد .

باکتری‌ها (Bacteria) که در کلمه مفرد باکتریوم نامیده میشوند از خانواده سلول های پروکاریوتی هستند و  از اصلی ترین گروه در  پیکره ی پروکاریوت ها محسوب میشوند.  باکتری‌ها بسیاری از خصوصیات و ویژگی های یک موجود زنده را دارند  که در زیر به چند مورد آن اشاره میکنیم :

باکتری‌ها از سلول تشکیل شده‌اند  و DNA  موجود در آنها حاوی اطلاعات ژنتیکی است . برخی از گونه های آنها تولید مثل می کنند و برای رشد نیاز به دریافت انرژی از محیط پیرامون خود دارند.

از آنجاییکه اغلب ، بین باکتری ها و عوامل بیماری زا ارتباطی وجود داشته است ، معمولا آنها را از جنبه بیماری زایی مورد مطالعه و بررسی قرار داده اند. ولی باید توجه داشت که به دلیل وظیفه ی مهم آن ها در ایستم ، نقش برجسته و سودمندی در ایجاد نظم و هماهنگی بین چرخه های موجودات زنده دارند که میتوان به موارد زیر اشاره کرد:

• باکتری ها باعث تغییرنیتروژن جوی به شرایطی مناسب  حیات گیاهان می شوند .
• ایجاد ارتباط و هماهنگی بین ارگانسیم ها بطوریکه یه تعامل دو طرفه ایجاد می شود .
• عامل تجزیه مواد دفعی از دیگر موجودات زنده و بازیافت آنها
• آسان کردن جریان هضم غذا در دستگاه گوارش
• یکی از عوامل مهم در جریان تولید ، در صنعت مواد غذایی
• یکی از عوامل موثر در تصفیه فاضلاب‌ها
• نقش مهم و ویژه ای در تولید برخی از دارو ها و درمان های نوین پزشکی

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت استخراج DNA از بافت مراجعه کنید. از کیت استخراج DNA از بافت میتوانید برای نمونه های سلول حیوانی، بافت حیوانی، خون، باکتری ، بافت پارافینه ، مخمر ، قارچ ، بزاق ، سواب و شیر استفاده کنید.

در واقع باکتری‌ها به وفور در همزیستی با موجودات دیگر در دنیا وجود دارند.این موجودات با تراکم بالایی در خاک و یا حتی در آب نیز هستند و دلیل بسیاری از عوامل بیماری‌زا محسوب می شوند و از نظر ساختاری معمولا بسیار کوچک  هستند .

باکتری‌ها مانند سلول‌‌های گیاهی و قارچی دارای دیواره سلولی هستند با این تفاوت که این دیواره ترکیبات متفاوتی دارد. دیواره باکتری ها از پپتیدوگیلیکان است. حرکت باکتری ها با استفاده از تاژک انجام میگیرد.از نظر شکل ظاهری متفاوتند . برخی کروی ، برخی میله ای یا مارپیچ هستند. با اینکه باکتری ها تک سلولی هستند ولی معمولا به دلیل تجمع کنار همدیگر ساختار خوشه ای یا زنجیره ای به خود میگیرند.

یکتا تجهیز آزما

اولین مرحله بیان ژن رونویسی یا به عبارتی دیگر transcription  نامیده میشود که بخشی از یک رشته RNA از رشته الگوی DNA ساخته می‌شود. این واکنش توسط آنزیمی به نام RNA پلیمراز کاتالیز می‌شود. رشته RNA سنتز شده به صورت موازی، مع و مکمل DNA رشته الگو است. بخش‌هایی از رشته ‌DNA که توالی RNA را رمز گذاری می‌کنند، تحت عنوان واحدهای رونویسی شناخته می‌شوند که می‌توانند بیش از یک ژن را در بر داشته باشند.

رونوشت RNA می‌تواند به صورت RNA پیام رسان در مکانیسم‌های سنتز پروتئین استفاده شود یا در سایر مکانیسم‌های متفاوت سلولی وارد عمل شود. RNAهای عملکردی و غیر کد کننده می‌توانند به صورت RNAهای انتقال دهنده یا RNA های ریبوزومی فعالیت کنند یا تبدیل به RNAهای تنظیمی مانند RNAi یا RNA مداخله‌ کننده برای تنظیم بیان ژن و تشکیل هتروکروماتین شوند. هتروکروماتین‌ها ساختاری متراکم از DNA هستند که در این حالت رونویسی از DNA انجام نمی‌شود.

نقش فرایند رونویسی در سلول

فرضیه ای وجود دارد مبنی بر اینکه زمانی زندگی بر روی زمین از همانند سازی RNA آغاز شد که این مولکول به عنوان ترکیبی کاتالیتیکی و حمل کننده اطلاعات ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گرفت. همزمان با تکامل موجودات زنده در طول زمان، پروتئین‌ها وظیفه کاتالیزی را بر عهده گرفتند، زیرا آن‌ها با توالی‌ها و ساختار متنوع خود سازگاری بیشتری با فعالیت‌های کاتالیزی داشتند. به همین دلیل، DNA به عنوان یک مولکول جایگزین برای حمل اطلاعات ژنتیکی مورد استفاده سلول‌های موجودات زنده قرار گرفت. مولکول DNA نسبت به RNA از مقاومت و پایداری بیشتری برخوردار است.مکانیسم رونوشت برداری به عنوان رابطی بین دو مولکول قرار گرفت، با این کار برای سلول‌ها امکان استفاده از یک مولکول نوکلئیک اسید پایدار به عنوان حمل کننده اطلاعات ژنتیکی فراهم شد و RNA به صورت بخش مهمی از مکانیسم سنتز پروتئین مورد استفاده قرار گرفت.

جدایی DNA از محل سنتز پروتئین موجب افزایش حفاظت از مواد ژنتیکی در برابر خطاهای بیوشیمیایی و بیوفیزیکی واکنش‌های پیچیده و چند مرحله‌ای سلول میشود. وجود خطا در مولکول‌های RNA احتمال کمی برای بوجود آمدن خطر برای سلول دارد، به این دلیل که این مولکول‌ها طول عمر بسیار کوتاهی دارند، در حالی که هر گونه تغییر در DNA موجب پیدایش جهش‌های ژنتیکی می‌شود که قادرند به صورت ارثی به نسل‌های بعد منتقل شوند. علاوه بر این، فرایند سنتز cDNA  لایه دیگری به تنظیمات پیچیده ژن اضافه کرده است، به خصوص در گونه‌هایی که دارای ژنوم بزرگی هستند و نیاز به تنظیمات زیادی جهت انجام متابولیسم دارند.

در سلول‌های یوکاریوتی، رونویسی نقش برجسته ای در انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به سیتوپلاسم دارد، به دلیل این که منافذ هسته‌ای برای عبور ریبوزوم‌ها، پروتئین‌ها یا کروموزوم بسیار کوچک هستند. اندازه منافذ هسته‌ای در حدود ۵ تا ۱۰ نانومتر است، در حالی که اندازه و قطر ریبوزوم‌ها ۲۵ تا ۳۰ نانومتر تخمین زده می‌شود و بسیاری از پروتئین‌ها بزرگتر از ۱۰ نانومتر قطر دارند، همچنین قطر کروموزوم‌هایی که به طور کامل متراکم شده‌اند، بیش از ۲۰۰۰ نانومتر محاسبه شده است. بنابراین ماشین اولیه سنتز پروتئین نمی‌تواند وارد هسته شود و رشته‌های DNA نمی‌توانند از هسته خارج شوند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت سنتز cDNA رجوع کنید.

 یکتا تجهیز اخوان 

پیدایش ویروس‌های جدید کاملاً مشخص نیست و احتمالا یک مکانیسم واحد برای پیدایش ایجاد ویروس‌ها وجود نداشته باشد. به دلیل اینکه ویروس‌ها قادر نیستند فسیل تشکیل دهند، تکنیک‌های مولکولی در فرضیه نحوه ظهور آن‌ها از اهمیت خاصی برخوردار است. تحقیقات در مورد شناسایی میکرو فسیل‌ها و زیست‌شناسی مولکولی هنوز هم می‌تواند شواهد فسیلی مربوط به دوره آرکی‌ها یا پروتروزوییک‌ها (Proterozoic) را تشخیص دهد. در حال حاضر دو فرضیه اصلی وجود دارد:

• ویروس‌ های کوچک با تنها چند ژن امکان دارد، بخش‌هایی از اسیدهای نوکلئیک فراری باشند که از ژنوم یک ارگانیسم زنده دیگر نشات می‌گیرند. مواد ژنتیکی آن‌ها می‌تواند از عناصر ژنتیکی قابل انتقال مانند پلاسمیدها که در باکتری‌ها به فراوانی یافت می‌شوند گرفته شده باشد. پلاسمیدها توانایی حرکت دارند و می‌توانند از سلول خارج شده و وارد ژنوم ارگانیسم‌های دیگر شوند.
• ویروس‌های دارای ژنوم بزرگتر، مانند Poxviruses، ممکن است روزی سلول‌های کوچکی بوده‌اند که به عنوان انگل روی سلول‌های میزبان بزرگتر رشد و تکثیر داشتند. در طول زمان، ژن‌هایی که برای روند زندگی انگلی‌ آن‌ها مورد نیاز نبودند، در یک پروسه ساده‌سازی از بین رفتند. دو باکتری ریکتسیا و کلامیدیا سلول‌های زنده‌ای هستند که مانند ویروس‌ها فقط می‌توانند در سلول‌های میزبان تولید مثل کنند. وجود آن‌ها به این فرضیه اعتبار می‌دهد، زیرا احتمالاً آن‌ها در جهت سبک زندگی انگلیشان ژن‌هایی را از دست داده‌اند که امکان زنده ماندن در خارج از سلول میزبان را برای آن‌ها فراهم می‌کردند.

در هر قسمت از این مقاله میتوانید به کیت استخراج ویروسی  (RNA ویروس) رجوع کنید.

بیماری‌های ویروسی انسان

نمونه‌هایی از بیماری‌های مشترک انسانی ناشی از ویروس‌ها شامل سرماخوردگی  ، آنفولانزا، آبله مرغان و تبخال هستند. علاوه بر این‌ها، ویروس‌ها می‌توانند بیماری‌های کشنده و مهلکی را نیز در انسان ایجاد کنند، از این گروه بیماری‌ها می‌توان به ابولا، کوید-19 ، ایدز، آنفولانزای مرغی و سارس اشاره کرد. توانایی نسبی ویروس‌ها در ایجاد بیماری با اصطلاح Virulence  یا شدت بیماری‌زایی تعریف می‌شود.

ردیابی، تخلیص و تشخیص ویروس‌ها

در آزمایشگاه، چندین روش برای رشد و شناسایی ویروس‌ها وجود دارد. تخلیص ذرات ویروسی را می‌توان با استفاده از روش‌های سانتریفیوژ افتراقی، سانتریفیوژ گرادیان، رسوب‌گذاری با سولفات آمونیوم یا اتیلن گلیکول و حذف اجزای سلولی از یک مخلوط سلولی همگن با استفاده از حلال‌های آلی یا آنزیم‌ها (در این حالت ذرات ویروس در محلول باقی می‌مانند) انجام داد.

آزمون‌هایی که برای شناسایی و شمارش ویروس‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، عبارتند از:

• سنجش هماگلوتیناسیون : روشی برای اندازه گیری کمی تعداد ذرات ویروسی در محلول گلبول‌های قرمز است، که با بررسی میزان رسوب یا آگلوتینه شدن ویروس‌ها در بین آن‌ها انجام می‌گیرد. در این تکنیک ویروس‌ها قادر به اتصال به سطح یک یا تعداد بیشتری از گلبول‌های قرمز هستند.
• شمارش مستقیم با استفاده از میکروسکوپ الکترونی: برای این کار مخلوطی رقیق از ذرات ویروس و دانه‌های با اندازه مشخص بر روی یک ورق مخصوص اسپری می‌شوند و تحت بزرگنمایی بالا مورد بررسی قرار می‌گیرند. در این حالت ذرات ویروس‌ها قابل شمارش می‌شوند.
• سنجش پلاک ویروسی:این تکنیک شامل رشد یک لایه نازک از سلول‌های باکتریایی بر روی یک محیط کشت و افزودن مخلوط رقیق ویریون‌ها بر روی آن است. ویروس‌ها سلول‌های روی محیط کشت را آلوده می‌کنند و باعث ایجاد سوراخ‌هایی در لایه سلولی می‌شوند که به پلاک معروف است. تعداد پلاک‌ها قابل شمارش است و تعداد ویروس‌ها را با توجه به آن‌ها می‌توان تعیین کرد.

تشخیص و جداسازی ویروس‌های جدید از بیماران، موضوعی تخصصی و آزمایشگاهی است. به طور معمول، برای این کار نیاز به استفاده از امکانات و تجهیزات گران قیمت و متخصصان آموزش دیده مانند کارشناسان علوم آزمایشگاهی، زیست‌شناسان مولکولی و ویروس‌شناسان است.

ادامه مطلب در منشا ویروس ها و کاربرد آن ها در علوم زیستی 

کنترل کیفیت فرایند استخراج DNA  ژنومی از خون به روش ستونی:

در قسمت قبلی توضیح دادیم که با استفاده از کیت استخراج DNA  از خون به روش ستونی  که محصولی وارداتی از کمپانی Favorgen تایوان است چطور روند استخراج DNA  از خون را طی کنید.  در این قسمت به کنترل کیفیت پروسه استخراج DNA  از خون میپردازیم.

در نظر داشته باشید که کیت های کمپانی Favorgen تایوان دقیقا مشابه با نمونه های اروپایی تولید شده است. بنابراین در تب فیلم های آموزشی میتوانید به فیلم کوتاه فرایند استخراج DNA  از خون مراجعه کنید.

پس از استفاده از کیت استخراج DNA  از خون باید به کنترل کیفیت فرایند انجام شده بپردازید.

تعیین کمی مقدار DNA استخراج شده با استفاده از کیت استخراج DNA از خون بوسیله دستگاه نانودراپ انجام می شود. نمونه های DNA با نسبت 260/280 بالای 1.7 و نسبت 260/230، به مقدار 2.2 دارای خلوص قابل قبول از نظر کیفیت DNA می باشند. همچنین جهت تعیین کیفیت نمونه هایDNA می توان این نمونه ها را بر روی ژل آگاروز 1% برده و وجود نمونه سالم و بدون اسمیر چک شود. (وجود اسمیر نشان دهنده ی خورد شدن DNA می باشد).

نحوه محاسبه نتیجه فرایند استخراج DNA به روش کمی:

با استفاده از دستگاه Nanodrop کمیت وکیفیت نمونه DNA بررسی می­شود. (HORC-UB-W-30-00)

محدوده مرجع:

غلظت نمونه DNA به ازای 200l خون کامل  5-50g  میباشدکه بستگی به نوع نمونه و تعداد سلولها دارد.  260/280: 1.7-2.0 و 260/230: 1.7-2.2 قابل قبول می باشد.

:OD260 جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 260 نانومتر است. جذب نوری DNA بطور اختصاصی در این طول موج بررسی می شود.

OD280: جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 280 نانومتر است. جذب نوری پروتئین بطور اختصاصی در این طول موج بررسی می شود.

OD230: جذب نوری نمونه مورد آزمایش در طول موج 230 نانومتر است. جذب نوری RNA ،EDTA ، فنل، گوانیدین تیو سیانات و کربوهیدراتها در این طول موج بررسی می شود.

محدوده قابل گزارش:

غلظت نمونه DNA بالای 10ng/l، با نسبت  260/280 مقدار 1.7-2.0 و نسبت 260/230 مقدار 1.7-2.2 قابل قبول می باشد.

محدوده هشدار:

غلظت نمونه DNA پایین تر  از 10ng/l و OD260/OD280  پایین تر از 1.7 و OD260/OD230  پایین تر از 1.7 مناسب نمی باشد.

پس از انجام فرایند استخراج DNA  ژنومی و کنترل کیفیت ممکن است با موارد غیر طبیعی رو به رو شوید و یکتاتجهیزآزما سعی بر آن دارد نکات فنی مهم را به شرح و با جزییات کامل جهت سهولت کاربران کیت استخراج DNA از خون توضیح میدهد.

در مجموع، مراحل استخراج DNA را بازنگری کنید و با مطالعه دقیق علت یابی مشکلات فنی کیت استخراج DNA  از خون به رفع عیوب ممکنه در مراحل استخراج DNA بپردازید.

روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)

چنانچه از مفهوم کلمه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) استنباط میشود،  درواقع مانیتوریگ لحظه به لحظه یک پروسه میباشد.از جمله عوامل موثر در بوجود آمدن روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) ،مشکلات و نقص های متعدد در PCR معمولی و نیز احساس نیاز به یک روند دقیق تر برای تعیین کمی آن بود.

در این فرایند تشخیصی یک ماده فلورسنت مثل سایبرگرین (SYBR Green) یا اوا گرین (Eva Green) با یک واکنش متناسب به مقدار محصولات هر سیکل (دوره) متصل میشود و مقدار فلورسنت آن بوسیله یک دیتکتور ( detector) ثبت میگردد.

مزایای روش ریل تایم (Real time PCR)

امکان رویت لحظه به لحظه یک واکنش مهیا است و در هر دوره ( سیکل) ، کاربر میتواند پروسه تکثیر را بررسی کند. به عبارت دیگر و بطور خلاصه تکثیر در هر زمان قابل رویت و بررسی است.
امکان شرایط ارتقا واکنش با مناسبترین غلظت DNA ، پرایمر و تعداد سیکل ها (دوره ها) برای تکثیر امکان پذیر است.
در هر زمان که کاربر تشخیص دهد میتواند برای جلوگیری از اتلاف وقت و انرژی ، واکنش را پایان دهد چراکه روند PCR قابل رویت و بررسی است و عدم تکثیر و رفتن به حالت س کاملا مشخص است.
میزان دقیق و نسبی الگوی اولیه قابل شناسایی است.
واکنش ها سریع تر و در زمان کوتاه تری انجام میشود.
محدوده تشخیص آن بیشتر از PCR معمولی است بطوریکه اختلاف کمتر از 2 برابر هم نشان میدهد.
دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)  با هدف تعیین میزان بیان ژن های موجودات زنده راه اندازی و ارتقا داده شده است. روش پی سی آر (PCR) ساده دارای نقص و محدودیت هایی از قبیل عدم توانایی مطالعه ی کمی میزان بیان یک ژن میباشد.

بنابراین سیستمی توسعه یافته با عنوان ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) ارائه شده است که هدف اصلی از این سیستم نشان گذاری ژن های موجودات زنده می باشد که مسیر کل مجموعه ژنومی منتهی به  ساخت محصولاتی از جنس RNA و پروتئین  میشود. در واقع  RNA  یا  ریبونوکلویک اسید های یک سلول می تواند قادر به تعیین خصوصیت و وجه تمایز یک سلول در سطح فنوتیپی دارد و نیز نشان میدهد در چه سطحی آن خصوصیت را بروز می دهد  .

از طرفی بجهت اینکه DNA همیشه ثابت بوده و یک ژن مشخص در بین موجودات یک گونه شباهت بسیاری به هم دارد و هیچ نشانه ای از میزان بیان آن ژن ارائه نمی دهد عمل مقایسه دو سلول از نظر خصوصیات و فنوتیپی را نمی توان در سطح DNA بررسی نمود،.بنابراین مطالعه ی بیان یک ژن می تواند در سطح RNA و یا پروتئین انجام پذیرد. همچنین بسیاری از ژن ها در نهایت به RNA تبدیل شده و نقششان را باعنوان RNA به انجام می رسانند. در نتیجه در برخی موارد محصول ژنی به شکل RNA عرضه شده و هیچ گاه قرار نیست به پروتئین ترجمه شود. در اینصورت برای بیان آن ژن مشخص که فقط رونویسی می شود ولی ترجمه نمی شود، فقط RNA مورد بررسی می باشد.

مولکول RNA یا ریبونوکلویک اسید به دلیل داشتن اکسیژن در کربن شماره 2 و همچنین تک رشته و کوتاه بودن آن، نسبت به مولکول های DNA واکنش پذیر تر بوده و تخریب پذیری بالایی دارد.

در ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) جهت بررسی بیان یک ژن، ابتدا با کمک آنزیم ترانس کریپتاز مع (آنزیم MMLV)  مولکول های RNA را سنتز و به DNA های مکمل که غالبا cDNA نامیده می شوند، تبدیل میکنند. پس از پایداری مولکول مورد سنجش، وارد سیکل های ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) شده و بیان مورد مطالعه قرار می گیرد. دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) از یک سیستم اپتیکی بهره برده که توسط آن میزان DNA هر نمونه محاسبه می گردد. زمانی که cDNA سنتز شد، پس از آماده سازی نمونه جهت ورود به سیکل های پلیمریزه شدن، به نمونه DNA رنگی تحت عنوان سایبرگرین (SYBR Green) اضافه می گردد. سایبرگرین (SYBR Green) موجب رنگ شدن DNA شده و همچنین خود دارای ویژگی فلورسانتی می باشد. زمانی که ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) سیکل های پلیمریزاسیون خود را شروع کرد، به ازای ساخته شدن رشته های DNA جدید، رنگ سایبر گرین (SYBR Green) به رشته متصل می شود و دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) توسط فناوری منحصربفرد  خود خوانش فلورسانتی را شروع می کند. لذا روش ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) با ویژگی فلورسنتی سایبر گرین (SYBR Green) برای هر نمونه یک گراف تکثیر ترسیم می کند. هر نقطه از گراف تکثیر نشان دهنده میزان اتصال سایبر گرین (SYBR Green) به رشته DNA می باشد و در نهایت گراف که در نمایشگر متصل شده به ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)  به نمایش در آمده، به آستانه خود می رسد. این میزان نشان دهنده میزان DNA بیان شده در هر نمونه می باشد.

حالا با توجه به توضیحات بالا در مورد  روش و مزایای ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR)  ، در زیر به نکات مهم و مختصری برای ختم توضیحات اشاره میشود:

عملکرد سایبرگرین چیست؟

سایبرگرین (SYBR Green) رنگی است که با قرار گرفتن بین پایه های DNA به مولکولهای دو رشته ای DNA متصل میشود.

این رنگ یکی از مواد تشکیل دهنده مسترمیکس سایبرگرین برای استفاده در دستگاه ریل تایم پی سی آر (Realtime PCR) میباشد زیرا با وجود این ماده دستگاه ریل تایم میتواند در انتهای هر چرخه توالی ، مقدار امپلیفای (amplify) شدن DNA  را اندازه بگیرد.

چرا سایبرگرین به DNA  اتصال پیدا میکند؟

هنگامی که محقق از مسترمیکس سایبرگرین استفاده میکند ، بعد از اتصال پرایمرها ، چند مولکول رنگ به رشته دوتایی DNA متصل میشود. اتصال به DNA  منجر به افزایش چشمگیر مولکول های سایبرگرین جهت انتشار نور میشود. در مرحله طویل شدن DNA تعداد مولکولهای سایبرگرین بیشتری به DNA  سنتز شده جدید متصل میشود.

حساسیت رنگ سایبرگرین موجود در مسترمیکس به نور چگونه است؟

رنگ سایبرگرین موجود در مسترمیکس ریل تایم حساسیت کمی به نور دارد بطوری که هر زمانی که برای کاربر امکان پذیر است باید از نور محافظت شود.

آیا رنگ سایبرگرین بی خطر است ؟

بله ، با توجه به تحقیقات بعمل آمده ، سایبرگرین نوعی رنگ سیانین است که در تحقیقات زیست شناسی مولکولی استفاده میشود و بی خطر بودن آن کاملا اثبات شده است.

مواد تشکیل دهنده مسترمیکس سایبرگرین چیست؟

غلظت مسترمیکس سایبرگرین 2x میباشد و حاوی KCl،  dNTP ، MgCl2، هات استارت تک (hotstart taq DNA polymerase) ، رنگ سایبرگرین و بافر بهینه شده میباشد.

منبع: یکتا تجهیز آزما

گاهی بعد از پروسه  استخراج DNA از خون با یکسری از مشکلات غیرطبیعی روبه رو میشوید. پیشنهاد میکنیم قبل از استفاده از کیت استخراج DNA از خون موارد و نکات زیر را به دقت مطالعه فرمایید.

از جمله مشکلات فنی  در استخراج DNA  با استفاده از کیت استخراج DNA از خون ، ادعای کاربر در مقدار بسیار کم DNA استخراج شده میباشد.

در ذیل به اختصار چند تا از نکات مهم و موثر  در بروز این مشکل عنوان میشود که از مهمترین عوامل موثر در عدم یا مقدار بسیار کم DNA استخراج شده است .

1 .مقدار کم سلول ها در نمونه ی اولیه

راه حل مناسب جهت رفع آن : استخراج DNA را با نمونه غلیظ تری از خون و یا از  بافی کوت انجام می دهیم .

2.لیز سلولی ضعیف به سه دلیل عمده اتفاق می افتد:

الف) کم بودن فعالیت پروتئیناز K

پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و از پروتئیناز K تازه و یا از استوک ان استفاده کنید.

ب) میکس ناکافی نمونه با BG

پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و نمونه با BG را کاملا میکس کنید .

پ) ناکافی بودن زمان انکوباسیون

پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید و زمان انکوباسیون را طولانی تر کنید.

3. اضافه نکردن اتانول به نمونه قبل از بردن روی ستون

پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.

4 .تهیه نادرست wash buffer که معمولا به دو دلیل زیر میباشد:

الف) در ابتدا اتانول به wash buffer اضافه نشده است.

اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 %  به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.

ب) حجم و درصد اتانول اضافه شده در ابتدامناسب نبوده است.

اطمینان حاصل کنید که حجم درست اتانول 100-96 %  به wash buffer در ابتدا اضافه شده است . پروسه استخراج را با نمونه جدید تکرار کنید.

5 .ناکارامد بودن الوشن بافر که  معمولا به دو دلیل زیر میباشد :

الف) پ هاش  اب (ddH2o) برای الوشن اسیدی است.

اطمینان حاصل کنید که PH ddH2o بین 9.0-7.5 است. از الوشن بافر اماده استفاده کنید.

ب) الوشن بافر یا ddH2o بطور کامل جذب ستون نشده است .

بعد از اضافه کردن الوشن بافر یا ddH2o ، پس از 5 دقیقه ستونها را سانتریفیوژ کنید.

ادامه مطلب در عیب یابی  و رفع آن در استفاده از کیت استخراج DNA از خون